本文根據廣東環凱微生物科技有限公司儀器廠副廠長駱延平在“中國飲料工業協會天然礦泉水分會第十三次會員大會暨技術交流會”上分享的報告整理而成。

水，是生命之源。近幾年來，在政府的高度重視和各生產廠家的共同努力下，包裝飲用水（包括天然礦泉水）的產品質量得到了質的提升，但在市場抽檢中不合格產品還是不時的被檢出，主要涉及微生物、理化指標、污染物*、界限指標等方面，其中因為微生物因素被檢出不合格的占70%以上。本文結合xin的食品安全國家標準GB 8537-2018和GB 19304-2018，分析飲用天然礦泉水微生物安全監控要點和技術，并分享xin的快速檢測技術。

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飲用天然礦泉水

微生物安全的主要風險

根據有關部門統計，2014年至2018年，國家及省級食藥監局共檢出2350批次不合格的桶裝水，其中，銅綠假單胞菌被檢出高達1551次，占比60.8%，成為桶裝水突出的質量安全問題。2017一2018年國省抽監督礦泉水抽檢的情況（廣東省），飲用天然礦泉水不合格率也達3.6%。這是由于桶裝水企業中中小型企業較多，回收桶存在較多的微生物安全問題，所以桶裝水生產企業抽檢不合格率較高，從而導致的抽檢不合格率較高。

國家標準規定，飲用天然礦泉水中不得添加任何防腐保鮮物質，使得其生產過程中的微生物污染控制要求更高；桶裝礦泉水回收桶存在大量微生物，造成清洗消毒比較困難；礦泉水藻類污染相當普遍，這些都是礦泉水生產微生物安全的風險所在，而這些風險又存在于生產過程的所有環節。

微生物風險主要環節

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飲用天然礦泉水

微生物安全監控要點

從2019年6月21日起，礦泉水生產企業實施更嚴格的飲用天然礦泉水國家標準：GB 19304-2018 《食品安全國家標準 包裝飲用水生產衛生規范》和GB 8537-2018《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水》 

● 新舊版標準在微生物要求方面的變化

在生產規范方面，增加了“包裝飲用水加工過程的微生物監控程序指南”，為礦泉水生產企業生產過程微生物監控提供了更具體的指引，但也并未給出具體的參考*，需要企業根據實際情況進行制定。

在產品標準方面，修改了大腸菌群、糞鏈球菌、銅綠假單胞菌和產氣莢膜梭菌的*和采樣方案，要求5份樣品不得檢出。

● 飲用天然礦泉水微生物安全監控要點

飲用天然礦泉水微生物安全監控是一個整體，貫穿于從水源到生產過程到包裝的全流程。

1、水源的保護和微生物監控是基礎

曾有調查顯示，檢測福建省77個生產廠家已投入灌裝生產的80處飲用天然礦泉水水源，結果 80個檢樣中18件水樣檢出銅綠假單胞菌，陽性率22.50％，其檢出率與水源的菌落總數和大腸菌群無顯著相關性。廣東省微生物研究所也曾對南方地區16家礦泉水生產企業的45份水源水進行檢測。結果顯示45份水源水中有11份樣品檢出銅綠假單胞菌,陽性率為24.44%。所以，自認為礦泉水水源深處地下，對水源的保護和微生物監控不予重視，寄希望于生產過程的后續殺菌，只會提高生產過程微生物消殺和監控的難度，增加成品微生物超標的風險。

2、 設備、管道、容器的微生物監控

采水設備、生產設備、管道、儲水容器、包裝容器等與產品直接接觸的接觸面在每次清洗消毒后都需要進行微生物監控，以確保不會對產品產生二次污染，接觸面的微生物*可參照成品微生物*的指標，重點是要關注生物膜的形成對接觸面微生物消殺和監控的影響。生物膜是一種附著于組織表面、由其自身產生的細胞外多聚基質包裹的有結構的菌細胞群體，由胞外基質及被黏連的菌細胞構成。根據我們的研究，銅綠假單胞菌容易形成生物膜，對外界不利環境有強烈的抵抗作用，對各種消毒劑不敏感，通透性差，因此形成生物被波的微生物不易被*清除。設備、管道、容器等不與產品接觸的非接觸面可根據所處環境潔凈等級要求進行微生物的監控，設備和管道的非接觸面的微生物監控可歸類到生產環境微生物監控中。

3、 生產環境的微生物監控

生產環境的微生物監控包含空氣（空間）微生物、人員表面微生物、設備和管道外表面微生物等的微生物監控。在xin國家標準GB 19304-2018中，只對灌裝防護區有具體的潔凈要求，具體的*我們可以參考GB 50687-2011 食品工業潔凈用房建筑技術規范中表4.2.2。

4、 生產過程的微生物監控

生產過程中微生物監控按GB 19304-2018 食品安全國家標準 包裝飲用水生產衛生規范中的附錄A表A.1參照執行。

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飲用天然礦泉水

微生物監控技術

● 監控的頻率

水源水：每年豐水期、枯水期各一次，特殊情況增加監測次數；

設備、管道、容器：每次清洗消毒后；

生產環境：每次消毒后；

過程水：每周、每兩周或每月一次（根據實際情況）；

成品水：每批次。

● 微生物監控方法

1、水源水、過程水及成品水：依據GB 8538-2016 食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法，采用濾膜法進行檢測。濾膜法微生物檢測基本配置：1、不銹鋼多聯過濾系統；2、無菌濾膜；3、濾膜夾子；4、配套培養基；5、其它實驗室常規微生物檢測設備及耗材。

2、設備、人員、容器等表面微生物監控：可參考標準有：2015版中國藥典；GB 15979-2002 一次性使用衛生用品衛生標準；GB 14934-2016 食品安全國家標準 消毒餐（飲）具；GB 15982-2012 醫院消毒衛生標準；GB/T 18204.4-2013 公共場所衛生檢驗方法 第4部分：公共用品用具微生物。歸納起來檢測的主要方法有：

2.1表面沖洗法：適用于監測大面積區域內表面的微生物含菌量，包括設備管道、儲水罐、包裝容器等。

2.2棉簽擦拭法：適用于所有表面微生物采樣，特別適用于不規則表面。

2.3接觸平皿（接觸碟）法：用于設備、車間、人員、包裝材料等平整表面的微生物采樣。可取代棉簽擦拭法，減少采樣步驟，確保取樣的準確性和安全性，符合新版GMP標準所規定的采樣要求，在藥企被廣泛使用。

3、空氣微生物監控：空氣微生物包括環境空氣微生物和壓縮空氣（空氣壓縮機、高壓氣瓶等）的微生物。環境空氣微生物的監控又分為沉降菌和浮游菌的的監控。

3.1 沉降菌：通過自然沉降原理收集在空氣中的活微生物粒子，通過的培養基，在適宜的生長條件下繁殖到可見的菌落數。根據xin標準GB 19304-2018 食品安全國家標準 包裝飲用水生產衛生規范中附錄規定，飲用天然礦泉水生產過程中沉降菌的測定標準是采用GB/T 18204.3-2013 公共場所衛生檢驗方法 第3部分：空氣微生物，但飲用天然礦泉水的灌裝防護區是潔凈區，與公共場所的微生物含量差別較大，公共場所的沉降菌檢測方法不適用于礦泉水生產的潔凈區，建議采用GB/T 16294-2010 醫藥工業潔凈室（區）沉降菌的測試方法進行檢測。

3.2 浮游菌：用浮游微生物采樣器，收集懸游在空氣中的生物性粒子，通過的培養基，在適宜的生長條件下繁殖到可見的菌落數。浮游菌的檢測方法可采用GB/T 16293-2010 醫藥工業潔凈室（區）浮游菌的測試方法。

3.3 沉降菌和浮游菌的差異：1.沉降菌屬于被動式采樣，浮游菌屬于主動式采樣；2.沉降菌指飄落在地面或物體表面的灰塵中攜帶的微生物；浮游菌指在空氣中漂浮的塵埃所攜帶的微生物；3.浮游菌濃度與沉降菌落數無線性關系,沉降菌的檢測不能替代浮游菌的檢測，要全面反映潔凈區內微生物的污染程度,需同時檢測沉降菌和浮游菌兩項指標。

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一種水源性致病菌快速檢測技術

環介導恒溫擴增技術，簡稱LAMP技術，是目前分子檢測手段中操作簡單、靈敏度高、特異性很好的檢測方法，具有廣闊的應用前景。

檢測原理：基于遺傳性的DNA或RNA，針對靶基因的6個區域設計4條引物，雙鏈DNA在65℃左右處于動態平衡狀態；利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在靶序列兩端引物結合處循環不斷產生環狀單鏈結構，使得引物在等溫條件下引發新鏈合成，從而使靶基因擴增，擴增后的產物會引起指示劑顏色或熒光吸收值變化，從而判讀結果。

產品應用：目前已有商業化的礦泉水中銅綠假單胞菌、產氣莢膜梭菌、糞性鏈球菌等檢測的LAMP檢測試劑盒。