接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)

一、接種
將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過(guò)程叫做接種。

接種和分離工具
1．接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀

常用的接種方法有以下幾種：
１）劃線接種 這是常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來(lái)回直線形的移動(dòng)，就可達(dá)到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。

２）三點(diǎn)接種 在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來(lái)觀察、研究它們的形態(tài)。除三點(diǎn)外，也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)行接種的。

３）穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常采用此法。做穿刺接種時(shí)，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺，如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動(dòng)，則在穿刺線周圍能夠生長(zhǎng)。

４）澆混接種 該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45°c左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達(dá)到稀釋的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物菌落。

５）涂布接種 與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來(lái)回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物的菌落。

６）液體接種 從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種。

７）注射接種 該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動(dòng)物中，常見(jiàn)的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來(lái)預(yù)防某些疾病。

８）活體接種 活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因?yàn)椴《颈仨毥臃N于活的生物體內(nèi)才能生長(zhǎng)繁殖。所用的活體可以是整個(gè)動(dòng)物；也可以是某個(gè)離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。

無(wú)菌操作
培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過(guò)滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無(wú)菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過(guò)程叫做無(wú)菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無(wú)菌操作。
(1)接種滅菌 (2)開(kāi)啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞。

二、分離純化
含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（mixed culture）。如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來(lái)自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)（pure
culture）。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過(guò)程稱為分離純化，方法有許多種。

１、傾注平板法
首先把微生物懸液通過(guò)一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40-50°左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次增殖后形成一個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。

２、涂布平板法
首先把微生物懸液通過(guò)適當(dāng)?shù)南♂專∫欢康南♂屢悍旁跓o(wú)菌的已經(jīng)凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無(wú)菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個(gè)菌落。

３、平板劃線法
簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無(wú)菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線。劃線的方法很多，常見(jiàn)的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí)，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，后在所劃的線上分散著單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成一個(gè)菌落。

４、富集培養(yǎng)法
富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡(jiǎn)單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長(zhǎng)，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，在生長(zhǎng)能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他微生物。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長(zhǎng)。通過(guò)多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。

５、厭氧法
在實(shí)驗(yàn)室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進(jìn)行接種。接種后，加入無(wú)菌的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用n2或co2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時(shí)為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在*密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。

三、培養(yǎng)
1、根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。
好氧培養(yǎng)：也稱“好氣培養(yǎng)”。就是說(shuō)這種微生物在培養(yǎng)時(shí)，需要有氧氣加入，否則就不能生長(zhǎng)良好。在實(shí)驗(yàn)室中，斜面培養(yǎng)是通過(guò)棉花塞從外界獲得無(wú)菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過(guò)搖床振蕩，使外界的空氣*地進(jìn)入瓶中。

厭氧培養(yǎng)：也稱“厭氣培養(yǎng)”。這類微生物在培養(yǎng)時(shí)，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過(guò)程中，重要的一點(diǎn)就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。一般可采用下列幾種方法：
a.降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位：常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，加入到培養(yǎng)基中，便可達(dá)到目的。有的將一些動(dòng)物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養(yǎng)基中，也可適合厭氧菌的生長(zhǎng)。
b.化合去氧：這也有很多方法，主要有：用焦性沒(méi)食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養(yǎng)吸收氧氣；用植物組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣；用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧。
c.隔絕阻氧：深層液體培養(yǎng)；用石蠟油封存；半固體穿刺培養(yǎng)。
d.替代驅(qū)氧 用二氧氣碳驅(qū)代氧氣；用氮?dú)怛?qū)代氧氣；用真空驅(qū)代氧氣；用氫氣驅(qū)代氧氣；用混和氣體驅(qū)代氧氣。
２、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類。

微生物常規(guī)鑒定技術(shù)

一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察
１、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過(guò)染色，在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進(jìn)行觀察，直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。

２、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落（colony）。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種
的細(xì)菌在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。以此可以對(duì)不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此，微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。

１）細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色（是水溶性色素還是脂溶性色素）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長(zhǎng)情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況。）

常見(jiàn)的細(xì)菌的培養(yǎng)特征
1.點(diǎn)狀 2.圓形 3.絲狀 4.不規(guī)則形 5.假根狀 6.紡錘狀 7.扁平 8.隆起 9.凸起10.墊狀 11.臍狀 12.邊緣整齊 13.波狀 14.裂片狀 15.嚙蝕狀 16.絲狀 17.卷發(fā)狀 18.絲線狀 19.刺毛狀 20.串珠狀 21.疏展?fàn)?/span> 22.樹(shù)根狀 23.假根狀 24.絲狀 25.串珠狀 26.乳頭狀 27.絨毛狀 28.樹(shù)根狀 29.量杯狀 30.蘿卜狀 31.漏斗狀 32.囊狀 33.層狀 34.絮狀 35.環(huán)狀 36.蹼狀 37.膜狀。

２）霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：
大多數(shù)酵母菌沒(méi)有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有均勻生長(zhǎng)、沉淀或在液面形成菌膜。
霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長(zhǎng)，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無(wú)限伸長(zhǎng)沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無(wú)色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。

二、生理生化試驗(yàn)
微生物生化反應(yīng)：指用化學(xué)反應(yīng)來(lái)測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來(lái)鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。

微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有：
１、糖酵解試驗(yàn)
不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣。可用指示劑及發(fā)酵管檢驗(yàn)。
試驗(yàn)方法：以無(wú)菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置36±1.0℃培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無(wú)改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無(wú)氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽(yáng)性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無(wú)微小氣泡，有時(shí)還可看出接種菌有無(wú)動(dòng)力，若有動(dòng)力、培養(yǎng)物可呈彌散生長(zhǎng)。
本試驗(yàn)主要是檢查細(xì)菌對(duì)各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進(jìn)行各種細(xì)菌的鑒別，因而每次試驗(yàn)，常需同時(shí)接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍(lán)和an-drade指示劑。

２、淀粉水解試驗(yàn)
某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。
試驗(yàn)方法：以18~24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個(gè)平板可分區(qū)接種，試驗(yàn)數(shù)種培養(yǎng)物）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1℃培養(yǎng)24~48h，或于20℃培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂。培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無(wú)色透明環(huán)、或肉湯顏色無(wú)變化。陰性反應(yīng)則無(wú)透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。
淀粉水解系逐步進(jìn)行的過(guò)程，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基含有淀粉量和ph等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基ph必須為中性或微酸性，以ph7.2適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時(shí)制備為妥。

３、v-p試驗(yàn)
某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱v－p（+）反應(yīng)。
試驗(yàn)方法：
１）o’meara氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液1ml加o’meara試劑（加有0.3%肌酸creatine或肌酸酐creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動(dòng)試管1~2min，靜置于室溫或36±1℃恒溫箱，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。亦有主張?jiān)?/span>48~50℃水浴放置2h后判定結(jié)果者。
２）barritt氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)4天、培養(yǎng)液2.5ml先加入5°cα萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.6ml，再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動(dòng)2~5min，陽(yáng)性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無(wú)紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36±1℃恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。
３）快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動(dòng)后放置5min，判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。
本試驗(yàn)一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時(shí)，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。

４、甲基紅（methyl red）試驗(yàn)
腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基ph值下降至ph4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。
試驗(yàn)方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)于36±1℃或30℃（以30℃較好）3~5天，從第二天起，每日取培養(yǎng)液1ml，加甲基紅指示劑1~2滴，陽(yáng)性呈鮮紅色，弱陽(yáng)性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果。
甲基紅為酸性指示劑，ph范圍為4.4~6.0，其pk值為5.0。故在ph5.0以下，隨酸度而增強(qiáng)黃色，在ph5.0以上，則隨堿度而增強(qiáng)黃色，在ph5.0或上下接近時(shí)，可能變色不夠明顯，此時(shí)應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)。

５、靛基質(zhì)（imdole）試驗(yàn)
某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。
試驗(yàn)方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管，于36±1℃培養(yǎng)24h時(shí)后，取約2ml培養(yǎng)液，加入kovacs氏試劑2~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽(yáng)性，或先加少量 （yi）醚（mi）或二甲苯，搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽(yáng)性。
實(shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，若先用二甲苯或 （yi）醚（mi）等進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。

６、硝酸鹽（nitrate）還原試驗(yàn)
有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾取喯跛猁}的存在可用硝酸試劑檢驗(yàn)。
試驗(yàn)方法：臨試前將試劑的a（磺胺酸冰醋酸溶液）和b（α－萘胺乙醇溶液）試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗(yàn)陽(yáng)性，若無(wú)紅色出現(xiàn)則為陰性。用α-萘胺進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，陽(yáng)性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對(duì)照。α-萘胺具有致癌性、故使用時(shí)應(yīng)加注意。

７、明膠（gelatin）液化試驗(yàn)
有些細(xì)菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。
試驗(yàn)方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點(diǎn)種于平板培養(yǎng)基。于20~22℃培養(yǎng)7~14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃。每天觀察結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時(shí)應(yīng)不加搖動(dòng)、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細(xì)菌液化，如確被液化，即為試驗(yàn)陽(yáng)性。平板試驗(yàn)結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑，若為陽(yáng)性，10~20min后，菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)。否則為陰性。

８、尿素酶（urease）試驗(yàn)
有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖冢?xì)菌均能合成此酶。其活性適ph為7.0。
試驗(yàn)方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖均，于36±1℃培養(yǎng)10，60和120min，分別觀察結(jié)果。或涂布并穿刺接種于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部，留底部作變色對(duì)照。培養(yǎng)2，4和24h分別觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作終判定，變?yōu)榉奂t色為陽(yáng)性。

９、氧化酶（oxidase）試驗(yàn)
氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì)胞色素c氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素c再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。
試驗(yàn)方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴，陽(yáng)性者kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色，ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色。陰性者無(wú)顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。

10、硫化氫（H2S）試驗(yàn)
有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。
試驗(yàn)方法：在含有流代流酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種，于36±1℃培養(yǎng)24~28h，培養(yǎng)基呈黑色為陽(yáng)性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營(yíng)養(yǎng)肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空，以不會(huì)被濺濕為適度；用管塞壓住置36±1℃培養(yǎng)1~6天。紙條變黑為陽(yáng)性。

11、三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)
試驗(yàn)方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。
本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來(lái)又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。

12、硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力（sim）瓊脂試驗(yàn)
試驗(yàn)方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽(yáng)性，混濁或沿穿刺線向外生長(zhǎng)為有動(dòng)力，然后加kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面，靜置10min，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性。培養(yǎng)基未接種的下部，可作為對(duì)照。
本試驗(yàn)用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。

三、血清學(xué)試驗(yàn)
血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗(yàn)中，常用血清學(xué)反應(yīng)來(lái)鑒定分離到的細(xì)菌，以終確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。

血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn)：
1)抗原體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時(shí)，會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。
2)抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。
3)抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。
4)血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無(wú)嚴(yán)格界限。階段為抗原體特異性結(jié)合階段，反應(yīng)速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢，但不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)現(xiàn)象。第二階段為抗原體反應(yīng)的可見(jiàn)階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢，需幾分、幾十分以至更長(zhǎng)時(shí)間。而且，在第二階段反應(yīng)中，電解質(zhì)、ph、溫度等環(huán)境因素的變化，都直接影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。
習(xí)慣上將經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)分三種類別：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。

１、凝集反應(yīng)
顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)（agglutination reaction）。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。在該反應(yīng)中，因?yàn)閱挝惑w積抗體量大，做定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)稀釋抗體。
１）直接凝集反應(yīng)
顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)的反應(yīng)，稱為直接凝集反應(yīng)(direct agglution reaction)。
a.玻片凝集法。是一種常規(guī)的定性試驗(yàn)方法。原理是用已知抗體來(lái)檢測(cè)未知抗原。常用于鑒定菌種、血型。如將含有痢疾桿菌抗體的血清與待檢菌液各一滴，在玻片上混勻，數(shù)分種后若出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集塊，即陽(yáng)性反應(yīng)，證明該菌是痢疾桿菌。此法快速、簡(jiǎn)便，但不能進(jìn)行定量測(cè)定。
b.試管凝集法。是一種定量試驗(yàn)方法。多用已知抗原來(lái)檢測(cè)血清中有無(wú)相應(yīng)抗體及其含量。常用于協(xié)助診斷某些傳染病及進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。如肥達(dá)氏反應(yīng)就是診斷傷寒、付傷寒的試管凝集試驗(yàn)。因?yàn)橐獪y(cè)定抗體的含量，故將待檢查的血清用等滲鹽水倍比稀釋成不同濃度，然后加入等量抗原，37℃或56℃，2~4小時(shí)觀察，血清高稀釋度仍有明顯凝集現(xiàn)象的，為該抗血清的凝集效價(jià)。

２）間接凝集反應(yīng)
將可溶性抗原（抗體）先吸附在一種與免疫無(wú)關(guān)的，顆粒狀微球表面，然后與相應(yīng)抗體（抗原）作用，在有電解質(zhì)存在的條件下，即可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反應(yīng)(indirect agglutination)。由于載體增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積。當(dāng)載體上有少量抗原與抗體結(jié)合。就出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)，敏感性很高。

2、沉淀反應(yīng)
可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)（precipitation）。反應(yīng)中的抗原稱為沉淀原，抗體為沉淀素。由于在單位體積內(nèi)抗原量大，為了不使抗原過(guò)剩，故應(yīng)稀釋抗原，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。
１）環(huán)狀沉淀反應(yīng)：是一種定性試驗(yàn)方法，可用已知抗體檢測(cè)未知抗原。將已知抗體注入特制小試管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原與抗體對(duì)應(yīng)，則在兩液界面出現(xiàn)白色的沉淀圓環(huán)。

２）絮狀沉淀反應(yīng)：將已知抗原與抗體在試管（如凹玻片）內(nèi)混勻，如抗原抗體對(duì)應(yīng)，而又二者比例適當(dāng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的絮狀沉淀，此為陽(yáng)性反應(yīng)。

３）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內(nèi)擴(kuò)散，若抗原抗體對(duì)應(yīng)，且二者比例合適，在其擴(kuò)散的某一部分就會(huì)出現(xiàn)白色的沉淀線。每對(duì)抗原抗體可形成一條沉淀線。有幾對(duì)抗原抗體，就可分別形成幾條沉淀線。瓊脂擴(kuò)散可分為單向擴(kuò)散和雙向擴(kuò)散兩種類型。單向擴(kuò)散是一種定量試驗(yàn)。可用于免疫蛋白含量的測(cè)定。而雙向擴(kuò)散多用于定性試驗(yàn)。由于方法簡(jiǎn)便易行，常用于測(cè)定分析和鑒定復(fù)雜的抗原成分。

3、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)
補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(complement fixation reaction)是在補(bǔ)體參與下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。補(bǔ)體無(wú)特異性，能與任何一組抗原抗體復(fù)合物結(jié)合而引起反應(yīng)。如果補(bǔ)體與綿羊紅細(xì)胞、溶血素的復(fù)合物結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，如果與細(xì)菌及相應(yīng)抗體復(fù)合物結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。因此，整個(gè)試驗(yàn)需要有補(bǔ)體、待檢系統(tǒng)（已知抗體或抗原、未知抗原或抗體）及指示系統(tǒng)（綿羊細(xì)胞和溶血素）五種成份參加。
其試驗(yàn)原理是補(bǔ)體不單獨(dú)和抗原或抗體結(jié)合。如果出現(xiàn)溶菌，是補(bǔ)體與待檢系統(tǒng)結(jié)合的結(jié)果，說(shuō)明抗原抗體是相對(duì)應(yīng)的，如果出現(xiàn)溶血，說(shuō)明抗原抗體不相對(duì)應(yīng)。此反應(yīng)操作復(fù)雜，敏感性高，特異性強(qiáng)，能測(cè)出少量抗原和抗體，所以應(yīng)用范圍較廣。